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站在共聚焦成像与双光子显微术的高水平上

    尼康A1R MP 是一款双光子显微成像系统，不仅具备高分辨率检流计式扫描器（galvanometer scanner），而且还配备了高速共振式扫描器（resonant scanner）。扫描速率在512 × 512像素水平下高达到30帧/秒；在带状扫描模式下最高可达420帧/秒。新型四通道NDD探测器（non-descanned detectors）具有更高的探测效率、更低的暗电流以及更宽的响应光谱，可以对谱线相近的荧光探针进行实时光谱拆分与识别，并大大提高荧光图像的对比度。此功能对于双光子显微镜非常重要，因为在双光子成像时一般只能使用单一的激发波长，往往不可避免地造成自发荧光以及发射光谱的重叠。

高达420帧/秒成像速率的共振扫描镜

     尼康所特有的共振扫描技术，较之于非共振的普通扫描器，大幅提高了宽视场扫描速率，达到了点扫描成像的世界级快速率-420帧/秒。利用多光子显微术专用的NDD探测器，可以对非常厚的标本进行深部快速成像。尼康的光学同步（optical pixel clock）技术充分保证了超高速图像的均匀性和稳定性。

     *1 NDD（Non-Descanned Detector）,与共聚焦技术不同，A1R MP不需要使用小孔滤波（descan）。使得NDD探测器可以安装在最靠近物镜出光口的位置，从而可以接收到更多的被厚标本散射的信号光，大幅提高灵敏度。

活体微循环成像

    通过A1R MP的超高速共振扫描，利用红外飞秒脉冲激光激发活体组织血管中的血细胞，并以30帧/秒（30msec）速率，三通道同时拍摄三色荧光图像。

    箭头标记的是对白细胞胞核运动的追踪。

    三种荧光探针同时成像：细胞核（蓝），内皮细胞层（绿），血浆（红）。长波长超快激光与超高速扫描器的结合有效降低光损伤的同时提供了高精度时间分辨率的多光子成像。图像分辨率：512×512pixels，图像采集速率：30帧/秒，物镜：60x水镜。

高灵敏度NDD深部成像

    尼康新开发的多光子四通道NDD探测器能够有效地进行标本深部的显微成像。较普通探测器而言，NDD的感光元件面积更大，灵敏度更高，并安装于距离物镜后出光口（back aperture）最近的地方. 该配置有效地提高了对散射荧光的探测效率，具有更高的信噪比（S/N），对诸如活体组织等较厚的标本的拍摄，具有比普通共聚焦显微镜更为清晰稳定的图像质量。

    对于标本深部成像来说，非常重要的一点就是要尽可能多地探测到散射荧光。而实际探测深度主要取决于探测器的灵敏度、受光面积以及安装位置。

    13.5日龄大鼠胚胎脊髓原基（神经管）的深部成像。样品为电转绿色荧光蛋白并培养24h后的完整胚胎。固定好的横切脊髓浸入凝胶中，并用红外脉冲激光进行双光子激发，可以观察到600微米以上的深部区域。

    NDD探测器拍摄的固定小鼠大脑神经元标本（eGFP染色）通过双光子红外激光（920nm）可以获得比常规共聚焦更高信噪比（S/N)的脑组织深部成像。能够实现深度在600微米以上光学切层观察。实验中使用了新型CFI Apo LWD 40x WI λs物镜。

新款高NA物镜成像更清晰，更明亮

    新款水浸物镜在较宽的波长范围内做了色差校正，保证了在近紫外到近红外波段内都有很高的透过率。其中尼康的CFI Plan Apo IR 60x WI是目前世界上数值孔径（NA）最大的60x水浸物镜，用它拍摄的高对比度显微图像具有非常出色的亮度和分辨率。

     一种原来为尼康半导体光刻机开发的超低折射率薄膜。由纳米颗粒组成海绵状“粗糙”结构，从而在很宽的光谱区间上大幅提升了光线透过率。

尼康双光子显微镜物镜

N 纳米水晶镀膜（Nano Crystal Coat-deposited）

                    图一                  图二                  图三

   （图一）转染GFP的13.5日龄大鼠胚胎脊髓原基（神经管），标本为经24小时培养后并固定的完整胚胎。神经上皮细胞与迁移中间神经元的连合轴突都清晰可见。

    （图三）表达eGFP小鼠大脑神经元的固定标本图像通过双光子红外激光（920nm）可以获得比常规共聚焦更高信噪比（S/N）的脑组织深部成像。

快速精准的光谱拆分

    A1R MP不仅可以通过光谱探测器进行32通道光谱拆分，而且实现了利用四通道NDD探测器的光谱拆分功能。此功能同样适用于高速共振扫描器。因此，A1R MP可以实现厚标本的深部高速高对比度成像。

   经Alexa488、MitoTracker Red和DAPI染色的标本，由光谱探测器拍摄的双光子激发图像并经光谱拆分处理。双光子红外激发光能够有效减少对细胞的损伤。

多光子激光光束的一键准直

    当多光子激光的波长或群速色散（GVD）预补偿发生改变时，激光的位置会发生偏移，导致荧光图像亮度不均匀，以及单光子图像与双光子图像之间的错位。

    由于人眼无法看见多光子激光，特别是800 nm以上波长。因此多光子激光束的准直工作对普通用户来说是十分困难也是十分危险的。尼康的A1R MP新开发的自动光束准直功能可以让用户轻点鼠标，瞬间完成多光子激光的光束准直。